NP-40裂解液
● 產(chǎn)品包裝：
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產(chǎn)品編號(hào)
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產(chǎn)品名稱
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產(chǎn)品包裝
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說明書
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RL1070
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NP-40裂解液
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100ml
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1份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
NP-40裂解液(NP-40 Lysis Buffer)是一種比較溫和的細(xì)胞組織裂解液。NP-40裂解液裂解得到的蛋白樣品可以最大限度地保持蛋白的活性狀態(tài)（native），可以用于常規(guī)的Western、IP和co-IP和ELISA等。NP-40裂解液的主要成分為 Tris(pH7.4)，NaCl，NP-40等。用NP-40裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測(cè)定樣品的蛋白濃度。
● 保存條件：
-20℃保存，一年有效。
● 注意事項(xiàng)：
1. 為取得最佳的使用效果，盡量避免過多的反復(fù)凍融?？梢赃m當(dāng)分裝后使用。
2. 需自備蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。
3. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
● 使用說明：
1. 準(zhǔn)備即用型裂解緩沖液：
向每1 ml 預(yù)冷的裂解緩沖液中加入磷酸酶抑制劑（自備）、蛋白酶抑制劑（自備），混勻，冰上預(yù)冷待用。注：即用型緩沖液建議現(xiàn)用現(xiàn)配，30分鐘內(nèi)使用。
2. 細(xì)胞總蛋白提取：
2.1 貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，加入適量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動(dòng)貼壁細(xì)胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，冰上裂解細(xì)胞5分鐘，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞收集于1.5 ml離心管中，冰上繼續(xù)裂解15分鐘，間歇混勻。
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培養(yǎng)板規(guī)格/培養(yǎng)皿表面積
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細(xì)胞量
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裂解液推薦使用量
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100 mm培養(yǎng)皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養(yǎng)皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養(yǎng)皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔板
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔板
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5×105
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100-150 μl
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96孔板
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細(xì)胞：450 g 4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；用適量1×PBS重懸細(xì)胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；重復(fù)漂洗細(xì)胞一次；按照細(xì)胞沉淀體積（PCM）20 μl加入200 μl 裂解緩沖液的比例加入裂解液，混勻細(xì)胞沉淀，冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
2.3 裂解細(xì)胞：
裂解混合物超聲波處理（超聲條件根據(jù)自有儀器調(diào)整）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號(hào)：PE2719 ，蛋白提取針頭套裝），以徹底裂解細(xì)胞。冰浴處理15分鐘。
注：裂解中細(xì)胞會(huì)釋放出變性的核酸，呈團(tuán)狀粘稠透明樣，如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導(dǎo)致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取得率和純度。研究蛋白互作實(shí)驗(yàn)，如Co-IP，考慮到超聲處理會(huì)影響蛋白之間的結(jié)合，可以不進(jìn)行超聲處理。
2.4 離心收集上清：
充分裂解后，4℃ 16000 g離心10分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
3. 組織樣品蛋白提?。?/b>
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的PBS或生理鹽水中，漂洗數(shù)次，洗凈組織血跡，用濾紙吸干組織表面液體，將組織切成細(xì)小的碎片。
3.2 按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入即用型裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次，收集勻漿后的裂解混合物，超聲波處理（超聲條件根據(jù)自有儀器調(diào)整）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號(hào)：PE2719，蛋白提取針頭套裝）,以徹底裂解細(xì)胞。裂解物冰浴處理15分鐘。
注：裂解中細(xì)胞會(huì)釋放出變性的核酸，呈團(tuán)狀粘稠透明樣，如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導(dǎo)致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取得率和純度。
3.4 充分裂解后，4℃ 16000 g離心10分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
4. 注意事項(xiàng)
4.1 所有的試劑及器具均需預(yù)冷后使用,以保持蛋白質(zhì)的完整性和活性。
4.2 產(chǎn)品中的保存條件及有效期均以未開封情況下計(jì)算，為了防止產(chǎn)品與空氣接觸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)影響產(chǎn)品性能，將未使用完畢的組分按存儲(chǔ)要求保存同時(shí)建議開封后的組分盡快使用完畢。
4.3 裂解細(xì)胞步驟使用超聲處理或針頭處理極其關(guān)鍵，否則蛋白得率會(huì)很低。
4.4 一般常規(guī)提取的蛋白樣品，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)不需要透析，但如果需要較大量的提取蛋白或后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果不理想，則需要將提取的蛋白樣品進(jìn)行透析脫鹽。
4.5 提取的蛋白質(zhì)可以采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（目錄號(hào)：RTP7102），由于裂解緩沖液中含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測(cè)定樣品的蛋白濃度。
4.6 如果用于蛋白質(zhì)質(zhì)譜研究，可采用快速蛋白銅染試劑盒（貨號(hào)：RTD6207）或快速蛋白鋅染試劑盒（貨號(hào)：RTD6206）或快速蛋白銀染試劑盒（貨號(hào)：RTD6401）對(duì)膠上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，這些染色方法對(duì)蛋白質(zhì)沒有修飾作用，所以對(duì)質(zhì)譜圖沒有影響。對(duì)于一般的染色，可以采用FastBlue蛋白染色液（貨號(hào)：RTD6202）來染色。
實(shí)驗(yàn)示例：
