柱式動物總蛋白提取試劑盒（細(xì)胞樣品，變性提?。?/b>
Column Animal Cells Denaturing Total Protein
Extraction Kit Ver.740164
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貨號
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產(chǎn)品名稱
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規(guī)格
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RTD8302
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柱式動物總蛋白提取試劑盒（細(xì)胞樣品，變性提?。?/span>
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50次
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● 產(chǎn)品包裝：
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貨號
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組份
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規(guī)格
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貯存
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RTD8302-01
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變性裂解緩沖液
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25 ml
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4℃
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CD-50
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離心柱套裝
（包含離心柱和2 ml連蓋收集管）
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50套
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RT
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● 產(chǎn)品簡介：
本試劑盒可從動物懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞中提取總蛋白，用變性裂解緩沖液配合離心柱裂解細(xì)胞，無需超聲處理打斷DNA，提取過程簡便高效，大約10分鐘即可完成蛋白提取，可以提取到細(xì)胞內(nèi)的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)（包括膜，細(xì)胞器，核，核基質(zhì)和胞質(zhì)蛋白）。獲得的總蛋白可用于SDS-PAGE
Western Blot檢測、免疫沉淀（IP）等后續(xù)研究。由于裂解緩沖液中含有SDS等強變性劑，不建議用于免疫共沉淀（Co-IP）、EMSA以及酶活性分析等與蛋白活性相關(guān)的實驗。
本產(chǎn)品提取的是細(xì)胞樣品的變性總蛋白，包括質(zhì)膜，細(xì)胞器，細(xì)胞核，核基質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白，提取的蛋白不適用非變性電泳。
按照每次使用~5×106培養(yǎng)細(xì)胞加0.5 ml裂解緩沖液計算，本試劑盒大約可以使用50 次。
● 保存、效期及運輸：
按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年；試劑盒常溫運輸。
● 用前必讀：
1.
離心機請調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），需要離心機轉(zhuǎn)速能達到16000
g（約20000
rpm），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機中進行。
2.
變性裂解緩沖液混勻后放置于冰上。將離心柱套裝蓋好管蓋，放置于冰上預(yù)冷。
3.
蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在裂解緩沖液中（添加時按照1:100添加，即1
ml裂解緩沖液 添加10
μl抑制劑）；研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。
4.
蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）。
● 使用說明：
一. 準(zhǔn)備即用型裂解緩沖液：
取適當(dāng)體積的預(yù)冷裂解緩沖液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的蛋白酶抑制劑（100×）（自備，試劑盒不提供），如果進行蛋白磷酸化研究，需要加入1/100體積的磷酸酶抑制劑
（100×）（自備，試劑盒不提供），隨后立即放于冰上待用。
二. 貼壁細(xì)胞蛋白提?。?/b>
2.1 將預(yù)冷的 1×PBS直接加入培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗貼壁細(xì)胞，吸去上清。
2. 2 按照下表中將相應(yīng)體積的變性裂解緩沖液均勻的加入整個器皿表面，用移液器吹打混勻，冰浴5分鐘。
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細(xì)胞類型
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培養(yǎng)器皿
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細(xì)胞數(shù)量
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細(xì)胞沉淀體積（PCV）（μl）
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裂解緩沖液（μl）
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貼壁細(xì)胞
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24孔板
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~5×105
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~5
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50
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6孔板
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~2.5×106
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~25
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200
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25cm2培養(yǎng)瓶
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~2×106
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~20
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200
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75cm2培養(yǎng)瓶
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~8×106
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~80
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500
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35
mm培養(yǎng)皿
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~2×106
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~20
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200
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60
mm培養(yǎng)皿
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~5×106
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~50
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500
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100
mm培養(yǎng)皿
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~1.5×107
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2-5×106
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200
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注： (二百萬，2×106)HeLa細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
2. 3 將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心柱中，4℃ 16000g 離心 1分鐘。
注：裂解中細(xì)胞會釋放出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如移液器不易吸取，可以將吸頭剪尖，保證將全部裂解物加到離心柱中。
2. 4 棄去離心柱，將收集管中蛋白溶液轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 ml
離心管中，即可用于蛋白濃度測定和后續(xù)實驗。注：如果收集管中有少許沉淀，只需收集上清即可。
三. 懸浮細(xì)胞蛋白提?。?/b>
3.1 400 g 4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；用1 ml 1×PBS重懸細(xì)胞，400 g 4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；重復(fù)漂洗細(xì)胞一次；留下細(xì)胞沉淀備用。
3.2 按照下表加入相應(yīng)體積的變性裂解緩沖液，用移液器重懸，冰浴處理5分鐘。
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細(xì)胞類型
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細(xì)胞數(shù)量
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細(xì)胞沉淀體積（PCV）（μl）
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裂解緩沖液（μl
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懸浮細(xì)胞
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~1×106
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~10
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100
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~2×106
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~20
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200
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~5-10×106
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＞50
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500
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注： (二百萬，2×106)HeLa細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
3. 3 將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心柱中，4℃ 16000g 離心 1分鐘。
注：裂解中細(xì)胞會釋放出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如移液器不易吸取，可以將吸頭剪尖，保證將全部裂解物加到離心柱中。
3. 4 棄去離心柱，將收集管中蛋白溶液轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 ml
離心管中，即可用于蛋白濃度測定和后續(xù)實驗。注：如果收集管中有少許沉淀，只需收集上清即可。