BN電泳樣品制備試劑盒
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產(chǎn)品編號
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產(chǎn)品名稱
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產(chǎn)品包裝
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RTD8304
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BN電泳樣品制備試劑盒
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50-100次
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● 產(chǎn)品包裝：
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貨號
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組份
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規(guī)格
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貯存
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RTD8303-01
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10% DDM
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1 ml
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-20℃
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RTD8303-02
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5%
Digitonin
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1 ml
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-20℃
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RTD8303-03
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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10 ml
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-20℃
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RTD8303-04
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5% G-250染料
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1 ml
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-20℃
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● 產(chǎn)品簡介：
Blue/Clear
Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一種從生物樣品（質(zhì)膜，胞漿等）中分離分子量10 kD-10 M kD 范圍的蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳技術(shù)。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)將蛋白復(fù)合體從細(xì)胞膜中以近似天然的狀態(tài)分離出來，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍(lán)
G-250 代替 SDS與蛋白結(jié)合而使其帶負(fù)電荷，根據(jù)蛋白分子量不同在 PAGE膠中得到分離；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電泳緩沖液中不加入任何染料，電泳中始終保持蛋白的天然電荷和活性狀態(tài)，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue
Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考馬斯亮藍(lán)G-250存在，使蛋白都覆蓋上負(fù)電荷，可以分離堿性蛋白（pI＞7）；而CN-PAGE只適合于酸性蛋白（pI＜7）的分離。
BN電泳樣品制備試劑盒含有BN/CN電泳樣品上樣所需要的試劑，包括兩種最常用的即用型非離子型去垢劑-DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）和Digitonin（毛地黃皂苷），這些去垢劑可以有效提高膜蛋白樣品的溶解性，避免電泳中產(chǎn)生樣品拖尾現(xiàn)象。
以每次處理100μl（10-20 μg/μl）樣品計(jì)算，該試劑盒可以使用50-100次。
● 保存條件：
-20℃保存，一年有效。
● 使用說明：
一 用前必讀：
1. 由于蛋白樣品的多樣性，不太可能提供一種通用的BN蛋白樣品制備和上樣程序。用戶可以根據(jù)自己的樣品種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，適當(dāng)調(diào)整實(shí)驗(yàn)程序，找到最適合的使用方法。
2. 10% DDM和5% Digtonin溶液常溫溶化后如有沉淀，95℃加熱5分鐘至沉淀徹底溶解后使用。
3. BN電泳樣品不能使用含SDS的上樣緩沖液制備。
二 制備細(xì)胞器樣品BN上樣溶液：
以下程序用于提取好的細(xì)胞器樣品的BN電泳檢測，如線粒體和葉綠體樣品。
2.1 取制備好的細(xì)胞器沉淀，冰浴溶化。
2.2 根據(jù)下表制備樣品：
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試劑
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終濃度
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備注
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細(xì)胞器樣品體積
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as you wish
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BN電泳中每個(gè)泳道的蛋白上樣量盡量控制在50 μg以內(nèi)。樣品上樣液的濃度控制在2.5-5 μg/μl（上樣體積10-20 μl）。使用者可以根據(jù)樣品濃度適當(dāng)調(diào)整。
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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1×
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10%
DDM或5%
Digitonin
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1%
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推薦使用的去垢劑終濃度為1%。很多樣品可能需要優(yōu)化去垢劑濃度。調(diào)整范圍為0.5-5% DDM或0.5-2.5% Digitonin。
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2.3 溶液冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
2.4 4℃ 20000 g離心30分鐘。
2.5 取上清加入5%
G-250染料，使其樣品中G-250終濃度為去垢劑終濃度的1/4。如使用終濃度1%去垢劑，樣品中G-250終濃度為0.25%。如使用其他去垢劑終濃度，請調(diào)整G-250染料的加入體積。
三 制備細(xì)菌、組織或細(xì)胞BN上樣溶液：
3.1 參考下表制備不同樣品裂解物：
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試劑或樣品
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操作或使用體積
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終濃度
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備注
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E.coli
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取細(xì)菌菌液1-2
ml，加入上樣緩沖液和去垢劑，冰浴超聲處理（推薦30-50%功率，超聲2秒，間隔3秒，超聲2分鐘）
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-
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盡量取對數(shù)生長期細(xì)菌，OD600在0.6-1.0之間
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培養(yǎng)細(xì)胞
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1×107細(xì)胞加入上樣緩沖液和去垢劑，用移液器吹打8-10次重懸細(xì)胞沉淀
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新鮮組織
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10-50 mg新鮮組織加入上樣緩沖液和去垢劑，用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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125 μl
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1×
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10%
DDM或5%
Digitonin
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50 μl 或100 μl
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1%
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推薦使用的去垢劑終濃度為1%。很多樣品可能需要優(yōu)化去垢劑濃度。調(diào)整范圍為0.5-5% DDM或0.5-2.5% Digitonin。
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滅菌水
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定容至500
μl
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3.2 裂解物冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
注：某些樣品裂解后會釋放出大量核酸，使得裂解后的樣品比較粘稠，可以加入DNase消化核酸（貨號：RTT2103）。
3.3 4℃ 20000 g離心30分鐘。
2.4 取上清加入5%
G-250染料，使其樣品中G-250終濃度為去垢劑終濃度的1/4。如使用終濃度1%去垢劑，樣品中G-250終濃度為0.25%。如使用其他去垢劑終濃度，請調(diào)整G-250染料的加入體積。
四 樣品檢測：
蛋白電泳可以選擇Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（貨號：RTD6139）進(jìn)行檢測；電泳后凝膠染色可以使用FastBlue蛋白染色液（貨號：RTD6202）；電泳后凝膠的轉(zhuǎn)膜可以使用10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：BC600P）。