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M-MLV(RNase H-) 反轉(zhuǎn)錄酶

M-MLV(RNase H-) 反轉(zhuǎn)錄酶

產(chǎn)品編號:RTR2102

產(chǎn)品規(guī)格:2000U

數(shù)量
價格 ¥200


Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-

       M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase缺失)      

●  產(chǎn)品貨號及規(guī)格:

貨號

名稱

濃度

包裝

貯存

RTR2102-01

Reverse Transcriptase M-MLV

RNase H-

200U/μl

2000U

-20℃

RTR2102-02

5×RT buffer

5×

0.2 ml

-20

產(chǎn)品簡介:

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-),是一種經(jīng)過改造和優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄酶。和普通的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶相比,缺失了Ribonuclease H (RNase H)酶活性,不能夠選擇性剪切RNA和DNA雜合雙鏈中的RNA,可以合成長片段從DNA。

本產(chǎn)品中M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的濃度為200 U/μl,用于體積為20微升的反轉(zhuǎn)錄體系時足夠進行10次反轉(zhuǎn)錄反應。

特點:M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)可以合成長達9-13kb的cDNA。該反轉(zhuǎn)錄酶的最適反應溫度為42-45并且在55時仍然有很高活性,可以避免普通的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)在37℃反應時的一些不足。

用途:M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)常用于在獲得總RNA或mRNA后cDNA第一條鏈的合成。合成的cDNA第一條鏈后續(xù)可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二條鏈的合成等。

來源:該反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)由大腸桿菌表達

活性定義:One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at37. Enzyme activity is assayed in50 mMTris-HCl (pH 8.3),6 mMMgCl2,10 mMDTT,40 mMKCl,0.5 mMdTTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP0.4 mMpolyA?oligo(dT)12-18.

純度:不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶,可以滿足常規(guī)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈等的需要。

酶儲存溶液:50 mMTris, pH 8.3,100mMNaCl,1 mMEDTA,5 mMDTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。

5×RT buffer250 mMTris, pH 8.3 at25,250 mMKCl,20 mMMgCl2,50mM DTT。

失活或抑制:70℃孵育10分鐘可以導致M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)失活;EDTA、EGTA等螯合劑、無機磷酸鹽或焦磷酸鹽以及聚氨(polyamine)對該反轉(zhuǎn)錄酶(Rnase H-)有抑制作用。

使用說明:

cDNA第一鏈合成:

1. 0.2ml PCR管中配制模板/引物變性混合液:

加樣順序

試劑

使用量

1

模板RNA

1 ng-1 μg*

2(后面3種任選一種)

Oligo(dT)18 primer(100 μM)

or Random primer(100 μM)

or Specific primer(10 μM)

0.5 μl

3

RNase-free

Up to 6 μl

注:* Total RNA 的使用量一般為1 ng-1 μg;mRNA的使用量一般為 10 pg-1 μg。

2.70保溫 10 分鐘后迅速在冰上急冷 2 分鐘以上。

注:此步驟是打開RNA的一些比較穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。

3. 離心數(shù)秒鐘使模板 RNA/引物的變性混合液聚集于離心管底部。

4. 在上述離心管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應液。

加樣順序

試劑名稱

使用量

1

模板/引物變性混合液

6 μl

2

5×RT buffer

2 μl

3

10mM dNTP

0.5 μl

4(可選)

RNase Inhibitor(40U/μl)

0.25μl

5

M-MLV(RNaseH-)

0.25-1μl*

6

RNase-free

up to 10μl

* 當起始模板 RNA量>500 ng 時, M-MLV(RNase H-)的使用量應>0.25 μl。

5. 若使用Oligo(dT)18或基因特異性引物,42℃溫育30 min;若使用隨機引物,先30℃溫育5 min,之后42℃溫育30 min;

6. 70℃保溫10分鐘后冰上冷卻,得到的 cDNA溶液可直接用于PCR擴增,PCR擴增時 cDNA溶液的推薦使用量50μl體系加2 μl。

注:cDNA溶液置于-20℃可保存半年;置于-80℃可長期儲存。



引用RTR2102 M-MLV(RNase H-) 反轉(zhuǎn)錄酶發(fā)表文章

使用該產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表:

1. [2018 IF=3.8] High-Throughput Sequencing Analysis of Small RNAs Derived from Coleus Blumei Viroids

Author: Dong-Mei Jiang , Meng Wang , Shi-Fang Li, Zhi-Xiang Zhang

Journal: Viruses 2019, 11, 619

Institution:Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences

Paper linkhttps://www.mdpi.com/1999-4915/11/7/619

 


 
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