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Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)

Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)

產(chǎn)品編號:WL0120F

產(chǎn)品規(guī)格:100ml

數(shù)量
價格 ¥200

WesternIP細胞裂解液(無抑制劑)

產(chǎn)品包裝:

產(chǎn)品編號

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品包裝

說明書

WL0120F

WesternIP細胞裂解液(無抑制劑)

100 ml

1

產(chǎn)品簡介:

Western及IP細胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors),是一種在非變性條件下裂解細胞的裂解液。本細胞裂解液裂解能力比較溫和,可以用于PAGE,Western,免疫沉淀(immunol precipitation,IP)和免疫共沉淀(Co-IP)。裂解液的主要成分為20 mM Tris (pH7.5),150 mM NaCl,1% Triton X-100等,裂解后能維持原有的蛋白間相互作用。由于含有較高濃度的Triton X-100等干擾物質,不能用傳統(tǒng)Bradford法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度,可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:RTP7102)或Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(貨號:RTP7104)測定蛋白濃度。使用本裂解液時,用戶可以根據(jù)具體用途自行添加特定抑制劑或者不添加抑制劑。

保存條件:

-20℃保存,一年有效。

注意事項:

1.為取得最佳的使用效果,盡量避免過多的反復凍融。可以適當分裝后使用。

2. 需自備PMSF或其他蛋白酶抑制劑;如進行蛋白磷酸化研究,還需要自備磷酸酶抑制劑。

3. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進行。

使用說明:

1.  準備裂解液:

溶解裂解液,混勻;取適當量的裂解液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的100 mM PMSF,使PMSF的最終濃度為1 mM。如進行蛋白磷酸化研究,需要加入磷酸酶抑制劑。

2. 細胞蛋白提取:

2.1 貼壁細胞:去除培養(yǎng)液,加入適量1×PBS,輕柔漂洗一遍,不要擾動貼壁細胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液,移液器吹打數(shù)下,使裂解液和細胞充分接觸,冰上裂解細胞5分鐘,用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離心管中,冰上繼續(xù)裂解15分鐘,間歇混勻。

培養(yǎng)板規(guī)格/培養(yǎng)皿表面積

細胞量

裂解液推薦使用量

100 mm培養(yǎng)皿

1.5×107

0.5-1 ml

60 mm培養(yǎng)皿

5×106

0.25-0.5 ml

35 mm培養(yǎng)皿

2×106

0.2-0.4 ml

6孔板

2.5×106

100-200 μl

24孔板

5×105

100-150 μl

96孔板

1×105

50-100 μl

2.2 懸浮細胞:450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;用適量1×PBS重懸細胞,450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;重復漂洗細胞一次;按照細胞沉淀體積(PCV)20 μl加入200 μl 裂解液,混勻細胞沉淀,冰浴處理15分鐘,間歇混勻。

注:2×106 Jurkat細胞,其細胞沉淀體積(PCV,Packed Cell Volume)大約為20 μl。

2.3 裂解細胞:

用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解或通過強烈渦旋震蕩使樣品裂解充分。冰浴處理15分鐘。

注:裂解混合物不建議使用超聲波破碎儀處理,因為超聲波處理比較劇烈,容易破壞蛋白的相互作用導致蛋白變性。

2.4 離心收集上清:

充分裂解后,4℃ 16000 g離心10分鐘,取上清,即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

3. 組織樣品蛋白提?。?/b>

3.1 手術切除的組織塊迅速置于預冷的生理鹽水中,漂洗數(shù)次,洗凈組織血跡,用濾紙吸干組織表面液體,將組織切成細小的碎片。

3.2 按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次,收集勻漿后的裂解混合物。裂解物冰浴處理15分鐘。

注:裂解混合物不建議使用超聲波破碎儀處理,因為超聲波處理比較劇烈,容易破壞蛋白的相互作用導致蛋白變性。

3.4 充分裂解后,4℃ 16000 g離心10分鐘,取上清,即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。


 
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